Micropropagazione e cappa a flusso laminare

[blackd.712]

wow! ottimi risultati!! continua così!!!

[Luis 22]

Complimentoni! Ottimo lavoro!

[levioloris]

Le prime prove di micropropagazione fotoautotrofa sembrano andar bene. Il terreno senza zuccheri non permette alle muffe di svilupparsi e i piccoli germogli di sarracenia stanno crescendo. Non resta che attendere per valutare velocità di crescita e di divisione cellulare e paragonarla con i risultati ottenuti con la normale micropropagazione.

La cosa si fa interessante, se funziona potrtebbe aprire la strada ad una via di propagazione molto più rapida per le sarre!

Ecco la foto:


Quelli che vedete sono un germoglio di sarra è alcune foglie di dionaea appena messe in coltura,( 2 giorni) per cui non si nota la crescita ( visibile invece nelle piastre più vecchie). Il Terreno è un Ms 1/3 con lo 0,2 % agar (praticamente liquido) senza zucchero , 2 ml/l kinetina e con vermiculite come supporto per le plantule. I contenitori sono forniti di 1,2 o 3 (al fine di testare il migliore) fori da 10 mm con un filtro da 0,3 micron ciascuno per far passare i gas ma non i patogeni contaminanti. Sopra ad essi è applicata una ventola al fine digenerare una corrente d'aria che faciliti gli scambi gassosi tra l'interno e l'esterno. Ciò permette alla Co2 di entrare ed essere fissata dalla pianta. Per ora sembra che un foro sia poco per garantire il corretto supporto energetico , due o tre sembrano avere invece un effetto migliore. Prossimamente testerò un sistema casalingo per arricchire l'atmosfera dei vasi con Co2 esogena.

[Prompt]

Ottimo lavoro e risultati entusiasmanti !

Prompt

[levioloris]

Ancora foto:
1- ecco un espianto fogliare di drosera capensis che, dopo aver formato callo, sta dando alla luce decine di nuovi piccoli germogli. Terreno solito con 0,5 ml/l kinetina:

2-Piccoli germogli di dionaea yellow dipartono dal callo in 0,5 ml/l metatopolina e 0,5 ml/l kinetina rispettivamente.


3- piccoli cephalotus messi in terreno di crescita:

4- dopo due mesi e mezzo i nuovi punti di crersctia formati da questa darli sono ormai incontabili:

5- Ecco i batteri che hanno occupato parte del mio tempo nell'ultimo periodo.
Dopo svariate ricerche bibliografiche e non son venutop a sapere che probabilmente si tratta di pseudomonas fluorescens, PGPR, plant growth promoting rizhobacteria. Batteri in grado di secernere un mix di ormoni vegetali (auxine come l'IAA, IAM e altre, citochinine e gibberelline) e di antibatterici/antimicotici come fenazina, pirrolnitrina e moltissimi altri, che normalmente vivono in simbiosi con le radici delle piante. La cosa interessante è che essendo aerobi (crescono in presenza di o2) in piastra, con concentrazione di o2 molto limitata, si sviluppano in modo controllato senza andare a disturbare la crescita della pianta. Anzi! La crescita in massa delle sarracenie, di cephalotus e di dionaea con questi batteri pigmentati (son quelli in rosso) risulta essere da 3 a 4 volte superiore rispetto alla crescita senza ormoni ( effetto dovuto principalmente alla produzione di auxine in elevate quantità). La scoperta è stata casuale :in una piastra inquinata le piante crescevano in modo smisurato e non riuscivo a capirne il perchè. Dopo qualche mese ho trovato la risposta e ora sto propagando questi batteri per sfruttarli in micropropagazione, avere dei produttori di ormoni e di antibatterici facili da riprodurre risulta economicamente vantaggioso. Spero di riuscire a sviluppare meglio in tesi specialistica questo tipo di simbiosi.


A presto!

[p-97]

Complimenti per gli ottimi risultati!
Paolo

[Aragorn73]

affascinante! non ci capisco nulla ma mi piace.

[nico1989_1]

affascinante! non ci capisco nulla ma mi piace.

quoto alla grande e super complimenti per gli esperimenti, veramente un grande!

[Homunculus]

Se non erro il concetto primario di questa procedura sarebbe quello di avere piante " pulite " da qualsiasi batterio muffa o cose che possono provocargli danno, quello che mi domando però è:

Bellissimo il fatto che si riesca ad ottenere piante " pulite " ma prima o poi dovranno andare in terra no? si "contamineranno" ugualmente? e poi... come reagiranno le radici al contatto col terreno? che non sempre può dare il massimo..

non penso che l'esperimento si concentri in una cultura in vitro e basta...
se qualcuno può darmi delucidazioni.. lo ringrazio

[Paolo CPI]

Il principio della micro propagazione prevede la coltura in terreni molto ricchi di sostanze nutritive che purtroppo sono terreni ideali per la proliferazione di muffe e batteri.

Sono quei terreni che nelle piastre Petri permettono il conteggio della carica batterica di acqua, alimenti, aria ecc.ecc.. ... da un singolo batterio (o spora di muffe) nascono in poco tempo colonie di migliaia di migliaia di batteri.

Ecco quindi l'importanza di tenere un ambiente , e un terreno, assolutamente asettico; basterebbe poco per infestare tutto e far morire gli innesti a causa delle variazioni di pH del terreno, della mancanza di elementi nutritivi che l'ammasso batterico avrà causato.

Le plantule che successivamente nasceranno necessiteranno naturalmente di un graduale ambientamento una volta che saranno pronti per essere spostati fuori da quella condizione, ma queste procedure sono relativamente semplici rispetto agli accorgimenti necessari per lavorare dall'inizio alla fine in ambiente sterile.

Quante volte ho pensato di cominciare a sperimentare questa tecnica (6 anni come responsabile C.Q in un laboratorio chimico/microbiologico di un azienda alimentare mi aiuterebbero a qualche cosa ...) ma sinceramente preferisco le mie talee.

Paolo

p.s. Comunque levioloris gran bel lavoro.

[CarloC]

Ottimi risultati!
E' molto interessante l'effetto del presunto Pseudomonas fluorescens

[levioloris]

Se non erro il concetto primario di questa procedura sarebbe quello di avere piante " pulite " da qualsiasi batterio muffa o cose che possono provocargli danno, quello che mi domando però è:

Bellissimo il fatto che si riesca ad ottenere piante " pulite " ma prima o poi dovranno andare in terra no? si "contamineranno" ugualmente? e poi... come reagiranno le radici al contatto col terreno? che non sempre può dare il massimo..

non penso che l'esperimento si concentri in una cultura in vitro e basta...
se qualcuno può darmi delucidazioni.. lo ringrazio

Il concetto primario è in realtà quello di produrre un elevato numero di piante, in poco spazio e con basso intervento dell'operatore. Il fatto che le colture siano asettiche è una necessità dovuta al tipo di coltura. Le piante in queste condizioni sono praticamente eterotrofe, cioè non fanno fotosintesi, o ne fanno pochissima, a causa della bassisima CO2 dei contenitori e vivono grazie ai carboidrati presenti nel terreno. Carboidrati che però permettono la cresita molto più rapida di uno svariato numero di microrganismi tra cui muffe e batteri, che impedirebbero la normale crescita della pianta ove non eliminati. Fanno marcire gli espianti oppure li ricoprono fisicamente, impedendogli di fare scambi gassosi per la respirazione e causandone la morte. L'effetto della variazione del pH e del consumo di sostanze nutrienti è solo secondario, il motivo principale per cui gli espianti crepano è appunto la copertura fisica oppure la presenza di patogeni per le piante, come le muffe, che causano marcescenza.
L'acclimatazione invece è quel processo finale con il quale le piante vengono spostate da condizioni di coltura in vitro a quelle in vivo. Anche qui, una volta eliminato il terreno e quindi gli zuccheri, il problema non sono i microrganismi bensì luce e umidità.
Bisogna abituare pian piano la pianta a far fotosintesi (troppa luce subito la "brucerebbe" ) e a resistere ad umidità minori di quelle a cui era abiutuata ( circa 100%). In pratica la morfologia della pianta in vitro non è uguale a quella in vivo e la pianta deve adattarsi, producendo pigmenti, chitina, attivando la regolazione stomatica ecc.
Come mostrerò negli esperimenti di micropropagazione fotoautotrofa le piante crescono e si moltiplicano in terreno senza zuccheri senza che queste siano state sterilizzate, basta che ci siano dei fori che permettano alla pianta di fissare la CO2 e di ridurre l'umidità interna per rendere possibile la traspirazione e quindi l'apertura degli stomi. Per cui l'asetticità è solo in funzione della tecnica usata per la propagazione, non lo scopo (almeno nel mio caso).
Spero di essermi spiegato bene, a presto!

[valerio]

Questo ulteriore passo in avanti della micropropagazione verso condizioni mixotrofe o addirittura autotrofe è molto interessante! Hai mai pensato di utilizzare il sistema ad immersione temporanea (TIS), per poter utilizzare substrati liquidi senza andare incontro a vitrificazione degli espianti?
Anche la crescita controllata di Pseudomonas fluorescens è una figata!! (perdonami il termine tecnico)
Ma per riprendere il discorso dell'ambientamento: l'hai già provato o per ora ti limiti a studiare varie tecniche di proliferazione e radicazione? Nel primo caso potresti descrivere la procedura che hai usato e che tassi di successo hai ottenuto?
Hai mai provato ad indurre morfogenesi senza passare per il callo (per ridurre il rischio di mutazioni)?
Grazie per condividere questa tua interessante esperienza con noi!

[levioloris]

Questo ulteriore passo in avanti della micropropagazione verso condizioni mixotrofe o addirittura autotrofe è molto interessante! Hai mai pensato di utilizzare il sistema ad immersione temporanea (TIS), per poter utilizzare substrati liquidi senza andare incontro a vitrificazione degli espianti?

Un sistema così richiederebbe tecnologie che permettano l'ingresso e l'uscita di liquido sterile da un recipiente, per cui non penso di aver le capacità di realizzarlo a livello casalingo.La micropropagazione fotoautotrofa posso dire che funziona ma senza un atmosfera arricchita di CO2 la crescita e troppo lenta rispetto alla normale micropropagazione, non ho interesse a fare una cosa così (arricchire di CO2), perchè ho paura di disperdere troppo le energie e non arrivare a conclusione in nessun progetto. Probabilmente in futuro.
Sarebbe interessante invece fare una mixotrofa utilizzando terreno liquido con zuccheri , con qualche foro per fare un pò di fotosintesi, e come supporto la vermiculite. Farebbe risparmiare sull'agar chè è il componente più costoso in assoluto.

[/quote]Anche la crescita controllata di Pseudomonas fluorescens è una figata!! (perdonami il termine tecnico) [/quote]

Si. Ho cambiato anche strategie ora, non utilizzo direttamente i batteri, ma li faccio crescere a parte con qualche piantina (sempre in provetta comunque), poi trasferisco le piante, prendo il terreno, lo autoclavo, abbasso il pH < 4,5 così l'agar non solidifica più e filtro il tutto usando una colonnina con del gel di agarosio allo 0,4-0,5 %. Ci mette na vita, 4 giorni, ma ottengo una soluzione che ha un buon contenuto di auxine, se non ci credi ecco i risultati in sarracenia:

A sx Sarracenia cresciuta con 50 ml/l di soluzione filtrata, a dx quella senza nulla.
Si vede anche che induce abbastanza radicazione sia in dionaea che in sarra. Direi comunque che la crecita e da due a tre volte superiore.

[/quote]Ma per riprendere il discorso dell'ambientamento: l'hai già provato o per ora ti limiti a studiare varie tecniche di proliferazione e radicazione? Nel primo caso potresti descrivere la procedura che hai usato e che tassi di successo hai ottenuto?[/quote]
Finora ho acclimatato darlingtonia sarracenie e drosere tutto col 100% di successo.
Il primo mese all'interno sotto luci artificiali, metto le piante in piccoli bicchierini di sfagno col solito sottovaso e li posiziono per:10 giorni con lampada distante, praticamente luce indiretta, 10giorni in cui avvicino lentamente le piante alla luce, 10 giorni sotto la luce. Durante tutte queste fasi uso una piccola ventola per ricircolare l'aria ed evitare lo sviluppo di muffe.
Le trasferisco poi fuori all'ombra per una o meglio due settimane e poi son pronte. Più si riesce a farle radicare in vitro prima si riprendono poi in vivo.

[/quote]Hai mai provato ad indurre morfogenesi senza passare per il callo (per ridurre il rischio di mutazioni)?[/quote]
Certo, con drosere e dionaea avviene in terreno senza ormoni, come fosse na talea normale, e nel caso delle dionaea anche con concentrazioni bassissime di kinetina, sotto lo 0,3 ml/l. Per Sarracenie non ho mai provato ancora a farle rigenerare da foglia ma per farle moltiplicare senza callo uso di solito metatopolina senza auxine (con le auxine fa sempre callo), darlingtonia e cephalotus li moltiplico sempre senza passare dal callo.
[/quote]Grazie per condividere questa tua interessante esperienza con noi! [/quote]
E' un piacere ragazzi, come è un piaceree rispondere alle vostre domande, a presto!

[valerio]

Ottimo, vedo che hai molto materiale su cui discutere e molti altri spunti per continuare a sperimentare
Per quanto riguarda il TIS, immaginavo che l'automatizzazione potesse essere un problema, ma non avendo esperienza diretta ho chiesto
Attualmente a che velocità di propagazione sei arrivato? intendo dal momento in cui prelevi l'espianto iniziale a quando porti ex vitro le plantule propagate. E quante plantule produci da un singolo espianto?
Ti rinnovo i mei complimenti! Ciao.